根據所配培養基的要求,從各母液只能感取出大量元素、微量元素、鐵液、維生素、激素、蔗糖等,置于容量瓶中定容至100ml,稱取瓊脂加入400ml置于大燒杯中加熱時不斷攪拌,十分鐘后瓊脂溶解,呈透明狀即可,放置稍涼。
溶解好的瓊脂溶液中加入第1項中所取出的各物質及糧溶液100ml,不斷攪拌使培養基混合均勻。
用PH計或試紙測PH值,用INNaOH或INNCL調至5.8。
將配制好的培養基分裝于清洗干凈,烘干后的三角瓶中,培養基高度約1cm左右,瓊脂約在40度時才凝固,所以有充足的時間業分裝。
將分裝好的培養基的三角瓶中塞上棉塞,大小要合適,然后包上牛皮紙,用橡皮盤扎緊。牛皮紙上標以記號準備滅菌。
培養基的滅菌與保存。
培養基內含有豐富的營養物質,有利于細菌和真菌繁殖,所以培養基配好后要及時滅菌,用高壓鍋滅菌注意以下幾點:
(1) 檢查鍋內的水量,一般高度到支持鍋座水平即可。
(2) 蓋好鍋蓋,擰緊螺旋,然后檢查排氣閥是事通暢。
(3) 用煤氣灶或電爐加熱,當氣壓指針上升至6時,放一次氣或打開放氣閥,加熱至鍋內冒出大量熱氣,以排盡鍋內空氣。
(4) 高壓鍋內溫度達1200C,0,1Mpa壓力時,這時保持高壓來菌20分鐘,以后切斷電源,是鍋內壓力自然慢慢下降,也可緩緩打開放氣閥放氣,使鍋內壓力接近于0(氣壓表指針下降至0),這時*打開放氣閥。
(5) 打開鍋蓋,取出培養基、滅菌水、培養皿、濾紙等。滅過菌的培養基通常置于100C下保存,待培養基放置2—3天后,瓶內水吸收干后即可使用。培養基滅菌后不宜久放,一般不超過一個月,多數情況滅菌后兩周內使用完。
接種——胡蘿卜愈傷組織的培養。
接種,是指經過消素好的材料在無菌的情況下切成小塊(外植體)并放入培養基的過程,要在無菌的環境中進行。接種進要求無菌操作,所有接種材料要預選消毒。
提前15分鐘將超凈工作臺打開過濾空氣。
雙手用肥皂洗凈,以70%乙醇棉擦試一遍。
取已洗凈的胡蘿卜5cm切段,用70%億醇浸炮30秒。然后無菌水沖凈,再2%安替福氏浸炮15秒,無菌水沖洗3——4遍置培養皿中。
在培養皿中用打孔器取下胡蘿卜的韌皮部切段,切去兩端,將材料切成厚3mm的薄片。
接種,用鑷子將材料薄片迅速接入培養基中,在酒精燈上移動著燒一下瓶口,塞上棉花塞。
培養,接好種的培養基,放置溫度23——28℃光照1000——5000LuX,光照時間每天約16——18小時的人工氣候箱中進行培養。隨著培養組織的不斷生長和細胞分裂,不久即形成愈傷組織并開始
植株誘導和轉載
除一些基尖,側牙球莖之類的材料能直接培養長大志植物外,葉,莖段,花瓣等要經過一個脫分化和再分化的過程,才能長成植株。
由于加入培養基中各種激素的比例不同,外植本可以沿著不同方向分化;一種是先由外植本產生愈傷組織,有愈傷組織再分化出不字根或不定芽,也可以由愈傷組織產生胚狀體,再發育成小植株:另一種是不經愈傷組織,可直接誘導出胚狀全而發育成植物。
不同來源的外植體再生植株的途徑
胡蘿卜肉質根誘導產生了愈傷組織之后,需進一步轉移至分化培養基誘導產生根和芽,以獲得再生植株。
生長點、側芽、原球莖、胚狀體根、莖段、葉、花芽、花瓣、胚狀體愈傷組織;再分化的芽和根;試管苗。
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